蛋白質(zhì)提取與純化技術(shù)

選擇材料及預處理 

以蛋白質(zhì)和結構與功能為基礎，從分子水平上認識生命現象，已經(jīng)成為現代生物學(xué)發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配到可用機械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析，有機溶劑提取，層析和結晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過(guò)物理力場(chǎng)的作用使各組分分配于來(lái)同區域而達到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、鹼、高溫，劇烈機械作用而導致所提物質(zhì)生物活性的喪失。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個(gè)階段：選擇材料和預處理，細胞的破碎及細胞器的分離，提取和純化，濃細、干燥和保存。

　　微生物、植物和動(dòng)物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據實(shí)驗目的來(lái)確定。對于微生物，應注意它的生長(cháng)期，在微生物的對數生長(cháng)期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時(shí)有兩種情況：

（1）得用微生物菌體分泌到培養基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；

（2）利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和胞內酶等。植物材料必須經(jīng)過(guò)去殼，脫脂并注意植物品種和生長(cháng)發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節性關(guān)系密切。對動(dòng)物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進(jìn)行絞碎、脫脂等處理。另外，對預處理好的材料，若不立即進(jìn)行實(shí)驗，應冷凍保存，對于易分解的生物大分子應選用新鮮材料制備。

蛋白質(zhì)的分離純化 

一，蛋白質(zhì)（包括酶）的提取

　　大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數與脂類(lèi)結合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。

（一）水溶液提取法

　　稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質(zhì)穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)zui常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時(shí)需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數蛋白質(zhì)的溶解度隨著(zhù)溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時(shí)間。但另一方面，溫度升高會(huì )使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過(guò)程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。

下面著(zhù)重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。

1、pH值
　　蛋白質(zhì)，酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應選擇在偏離等電點(diǎn)兩側的pH 范圍內。用稀酸或稀堿提取時(shí)，應防止過(guò)酸或過(guò)堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團發(fā)生變化，從而導致蛋白質(zhì)構象的不可逆變化，一般來(lái)說(shuō)，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。

2、鹽濃度
　　稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶，稱(chēng)為鹽溶作用。同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結合，具有保護蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

（二）有機溶劑提取法

　　一些和脂質(zhì)結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質(zhì)結合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別*，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內（度為10%，40度為6.6%）不會(huì )引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動(dòng)植物及微生物材料。

二、蛋白質(zhì)的分離純化

蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有：

（一）根據蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法

1、蛋白質(zhì)的鹽析

　　中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著(zhù)影響，一般在低鹽濃度下隨著(zhù)鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱(chēng)鹽溶；當鹽濃度繼續升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現象稱(chēng)鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4）有很強的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結并沉淀析出。鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。

　　影響鹽析的因素有：

（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時(shí)溶解度低，更容易鹽析。

（2）pH值：大多數蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度zui低。

（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著(zhù)其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(lái)（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋?zhuān)沟鞍踪|(zhì)含量在2.5-3.0%。

　　蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用zui多的硫酸銨，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數小而溶解度大（25度時(shí)飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時(shí)飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來(lái)；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調節。

　　蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時(shí)間較長(cháng)，所以在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過(guò)柱的辦法除鹽，所用的時(shí)間就比較短。

2、等電點(diǎn)沉淀法 

　　蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力zui小，因而溶解度也zui小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。

3、低溫有機溶劑沉淀法 

　　用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應在低溫下進(jìn)行。

（二）根據蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾 

　　透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開(kāi)。

　　超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。

2、凝膠過(guò)濾法 

　　也稱(chēng)分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質(zhì)混合物zui有效的方法之一。柱中zui常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。

（三）根據蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離

蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數量不同，可將其分開(kāi)。

1、電泳法

　　各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不同而得以分開(kāi)。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體，電泳時(shí)兩性電解質(zhì)形成一個(gè)由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動(dòng)時(shí)，到達各自等電點(diǎn)的pH位置就停止，此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。

2、離子交換層析法

　　離子交換劑有陽(yáng)離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時(shí)，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上，隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)。（詳見(jiàn)層析技術(shù)章）

（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法 

　　親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法，它經(jīng)常只需經(jīng)過(guò)一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來(lái)，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質(zhì)與另一種稱(chēng)為配體（Ligand）的分子能特異而非共價(jià)地結合。其基本原理：蛋白質(zhì)在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類(lèi)型的細胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學(xué)中的重要的一部分，至今還沒(méi)的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來(lái)，因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。

細胞的破碎 

1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至zui慢處，開(kāi)動(dòng)開(kāi)關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動(dòng)物內臟組織、植物肉質(zhì)種子等。

2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來(lái)回研磨，上下移動(dòng)，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。

3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鐘，此法的缺點(diǎn)是在處理過(guò)程會(huì )產(chǎn)生大量的熱，應采取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。

4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。

5、化學(xué)處理法：有些動(dòng)物細胞，例如腫瘤細胞可采用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可采用溶菌酶處理效果更好。

　　無(wú)論用哪一種方法破碎組織細胞，都會(huì )使細胞內蛋白質(zhì)或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質(zhì)量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過(guò)選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合于目的物質(zhì)的提取。

濃縮、干燥及保存 
一、樣品的濃縮
　　生物大分子在制備過(guò)程中由于過(guò)柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法的：

1、減壓加溫蒸發(fā)濃縮
　　通過(guò)降低液面壓力使液體沸點(diǎn)降低，減壓的真空度愈高，液體沸點(diǎn)降得愈低，蒸發(fā)愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。

2、空氣流動(dòng)蒸發(fā)濃縮 空氣的流動(dòng)可使液體加速蒸發(fā),鋪成薄層的溶液，表面不斷通過(guò)空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置于冷室，用電扇對準吹風(fēng)，使透過(guò)膜外的溶劑不沁蒸發(fā)，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適于大量溶液的濃縮。

3、冰凍法 生物大分子在低溫結成冰，鹽類(lèi)及生物大分子不進(jìn)入冰內而留在液相中，操作時(shí)先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質(zhì)融點(diǎn)介點(diǎn)的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時(shí)，不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結晶浮于液面，蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。

4、吸收法 通過(guò)吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學(xué)反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開(kāi)。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時(shí)，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，外加聚乙二醇復蓋置于4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達到所需要的體積。

5、超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過(guò)濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過(guò)膜時(shí)，溶劑和小分子透過(guò)，大分子受阻保留，這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新方法，zui適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優(yōu)點(diǎn)。應用超濾法關(guān)鍵在于膜的選擇，不同類(lèi)型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子zui小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來(lái)選用。另外，超濾裝置形式，溶質(zhì)成份及性質(zhì)、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo 超濾膜的分子量截留值：

膜名稱(chēng) 分子量截留值 孔的大的平均直徑 
XM－300 300，000               140
XM－200 100，000                55
XM－50 50，000                30
PM－30  30，000                22
UM－20 20，000                18
PM－10 10，000                15
UM－2 1，000                12
UM05 500                 10

　　用上面的超濾膜制成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動(dòng)。然后將纖維管浸入待透析的蛋白質(zhì)溶液中。當緩沖液流過(guò)纖維管時(shí)，則小分子很易透過(guò)膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過(guò)濾秀析法，由于透析面積增大，因而使透析時(shí)間縮短10倍。

二、干燥
　　生物大分子制備得到產(chǎn)品，為防止變質(zhì)，易于保存，常需要干燥處理，zui常用的方法是冷凍干燥和真空干燥。真空干燥適用于不耐高溫，易于氧化物質(zhì)的干燥和保存，整個(gè)裝置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同時(shí)增加了溫度因素。在相同壓力下，水蒸汽壓隨溫度下降而下降，故在低溫低壓下，冰很易升華為氣體。操作時(shí)一般先將待干燥的液體冷凍到冰點(diǎn)以下使之變成固體，然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結構等優(yōu)點(diǎn)，適用于各類(lèi)生物大分子的干燥保存。

三、貯存
　　生物大分子的穩定性與保存方法的很大關(guān)系。干燥的制品一般比較穩定，在低溫情況下其活性可在數日甚至數年無(wú)明顯變化，貯藏要求簡(jiǎn)單，只要將干燥的樣品置于干燥器內（內裝有干燥劑）密封，保持0－4度冰箱即可，液態(tài)貯藏時(shí)應注意以下幾點(diǎn)。

1、樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏，樣品太稀易使生物大分子變性。

2、一般需加入防腐劑和穩定劑，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質(zhì)和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩定性。此外，鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標準緩沖液中。

3、貯藏溫度要求低，大多數在0度左右冰箱保存，有的則要求更低，應視不同物質(zhì)而定。