CCK8試劑用于簡(jiǎn)便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細胞增殖和毒性分析。
1.將處于對數生長(cháng)期的各實(shí)驗組細胞胰酶消化后，*培養基重懸成細胞懸液，并計數。
2.根據細胞生長(cháng)快慢決定鋪板細胞密度(多數為1000-2000 cell/well)，每組3-5重復，每孔100-200μl培養基。根據實(shí)驗設計決定鋪板數量(如需要檢測5天，則鋪5張96孔板)，我們以1000 cell/well，5復孔，200μl培養基，檢測5天為例，各實(shí)驗組需要細胞數量為1000×5×5個(gè)細胞，從計數好的細胞懸液中取出所需的細胞量和*培養基混勻，體積為200×5×5μl。
3.統一鋪好后，待細胞*沉淀下來(lái)后，在顯微鏡下觀(guān)察各實(shí)驗組的細胞密度，如果密度不均勻，則固定一組，微調其他組細胞的量再次鋪板(如：發(fā)現NC組細胞較多，降低細胞量再次鋪板)，放入細胞培養箱中培養。
4.從鋪板后開(kāi)始，每孔加入10-20μl CCK-8溶液，如果每孔的培養基為100μl，則加入10μl CCK-8溶液，如果每孔的培養基為200μl，則加入20μl CCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì )影響OD 值的讀數)。用加了相應量細胞培養液和CCK-8溶液但沒(méi)有加入細胞的孔作為空白對照。
5.在細胞培養箱內繼續孵育1-4小時(shí)，對于大多數情況孵育2小時(shí)左右就可以了。
6.用酶標儀測定在450nm處的吸光度(使用酶標儀之前要提前開(kāi)啟10min預熱)測定完成后，保存數據。
7.連續五天檢測，每天保持一樣的時(shí)間點(diǎn)加入CCK-8溶液，在培養箱內孵育時(shí)間相同。
注：若暫時(shí)不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內測定，吸光度不會(huì )發(fā)生變化。
