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ELISA試驗中陰性的顯色和陰性的本底
以常用的間接法測抗體和夾心法測抗原為例。陽(yáng)性標本中含有檢測系統中特異的抗體或抗原,作為橋梁聯(lián)結免疫吸附劑和酶結合物,使酶結合物吸附在固相上,無(wú)色底物在酶的作用下轉變成有色產(chǎn)物,這就是陰性的顯色,顯色的深度與陽(yáng)性標本中待測抗體或抗原的量成正比。陰性標本中不含待測的抗體或抗原,酶結合物不能聯(lián)結在固相上,故不顯色。但ELISA是一個(gè)復雜的、多步驟的反應過(guò)程,反應各步中酶結合物都有可能非特異性的吸附在固相載體上,與底物反應呈現顏色,這就形成了陰性的本底。酶結合物在固相上的非特異吸附通常有以下幾條途徑。
(1) 酶結合物直接吸附在固相載體上。酶結合物是蛋白質(zhì),可以直接吸附在固相載體表面。但在ELISA這一步驟中選擇了不利于這種吸附的條件,一般說(shuō)來(lái)只要酶結合物工作濃度適當和反應后經(jīng)過(guò)*洗滌,可以避免這種吸附。
(2) 酶結合物與固相上包被蛋白質(zhì)成分起反應。包被抗原不純時(shí),雜質(zhì)蛋白也會(huì )吸附在固相載體上,某些雜質(zhì)可與酶標抗體因“錯認”而結合。
(3) 在間接法中,雜抗原還有可能與血清標本中的免疫球蛋白特異或非特異地結合。另外非特異的免疫球蛋白也可吸附在包被的特異抗原上,特別是這種抗原為堿性蛋白質(zhì)時(shí),此時(shí)酶標記的第二抗體就與吸附的免疫球蛋白反應而形成陰性本底。
(4) 在間接法中標本中的非特異免疫球蛋白的含量遠遠超過(guò)特異性抗體,因此可以直接吸附在固相上,這是形成陰性本底的主要原因。聚苯乙烯對免疫球蛋白有很好的吸附性能,IgM的吸附力大于IgG,聚合IgG的吸附力大于單體的IgG。酶標記的抗Ig(二抗)對吸附在載體上的Ig和與固相抗原結合的特異性Ig有著(zhù)同樣的親和力,因此在加入標本的反應中,雖然采取了不利于吸附的條件,但假設血清標本不作適量的稀釋?zhuān)邼舛鹊?/span>Ig中仍有一些能吸附在固相上,因而產(chǎn)生較高的本底。
(5) 在雙抗體夾心法中,標本中如含有類(lèi)風(fēng)濕因子,也能使陰性血清顯色。類(lèi)風(fēng)濕因子是作用于多種動(dòng)物IgG Fc段的自身抗體,多為IgM類(lèi),是一種多價(jià)抗體。在夾心法檢測中充當抗原成分,同時(shí)在固相抗體及酶標抗體反應,使酶標抗體結合到載體上。
(6) 在ELISA中引入生物素-親和素系統可以提高檢測的靈敏度,但如果使用不當,可使本底加深,反而得不償失。生物素標記蛋白質(zhì)如比例不合適,極易形成較高的陰性本底。從蛋清中提取的親和素是一種堿性糖蛋白,可以通過(guò)靜電作用吸附在聚苯乙烯上,也是造成BA-ELISA高本底的因素之一。從鏈球菌中提取的親和素改善了這一非特異吸附現象。
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