E14 小鼠胚胎干細胞

Mouse Embryonic Stem Cells ,ES-E14TG2a

貨號：YJ-m062（種屬鑒定）

價(jià)格： 1800.0

規格： 1*10⁶

細胞描述

小鼠胚胎干細胞。該細胞缺乏 HGPRT（HPRT），并且對 0.06 mM 的 6-硫鳥(niǎo)嘌呤有抗性。當在飼養層（胚胎成纖維細胞或 STO 細胞）上培養時(shí)，細胞保持未分化狀態(tài)。在沒(méi)有飼養層的情況下，細胞自發(fā)分化并形成胚胎結構。當注入胚泡中時(shí)，細胞可以進(jìn)入生殖系。在常規的分子基因修飾技術(shù)之后，它們可用于重構小鼠胚胎。培養時(shí)需使用昆明白MEF作為飼養層細胞。

細胞特性

1） 來(lái)源：小鼠，129/Ola品系，胚胎內細胞團

2） 形態(tài)：球形克隆 貼壁生長(cháng)

3） 含量：>1x10^6  細胞數

4） 規格：1mL凍存管包裝

5） 用途：僅供科研使用

運輸和保存

干冰運輸：1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過(guò)夜后轉入液氮或直接復蘇，若發(fā)現干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

一．培養基及培養凍存條件準備：

1）準備DMEM 基礎培養基                      (YJ-0001)                                  81%      

優(yōu)質(zhì)胎牛血清                                            （YJ-0500）                              15 %

GlutaMAX-1谷氨酰胺                                ( YJ-0900 )                                1 %

MEM NEAA非必需氨基酸                         (YJ-01000)                                1%

Sodium Pyruvate丙酮酸鈉                         ( YJ-01100 )                                1%

P/S青霉素-鏈霉素                                  （YJ-15140-122）                         1%

β-巰基乙醇                                                  (YJ-8211)                                   0.5 mL（1000X)

LIF                                                                (YJ-50756)                                 5μg（10ng/mL）

使用昆明白MEF作為飼養層細胞。

2）培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：完全培養液 60%%，FBS 30%%，DMSO 10%%現用現配。

我庫凍存時(shí)，體積為 500 μl，預期存活率 70%，每支凍存管的細胞復蘇，3 至4 天后，會(huì )形成 30 至 40 個(gè)克隆，建議復蘇至 1 個(gè) T25 培養瓶中。

二：細胞處理：

MEF 細胞鋪制：

1. 在 T25 培養瓶中加入 0.2%明膠，搖勻后覆蓋底面即可，于 37℃細胞培養箱至少放置 15 min 以上。

2. 吸除 0.2%明膠，加入事先水浴加熱至 37℃的 MEF 完全培養液。一般地，一個(gè) T25 培養瓶中加入 5 ml MEF 完全培養液。

3.  按實(shí)驗需要：小鼠胚胎干細胞使用 KM-r P3 MEF 或 CF-1 P3 MEF；復蘇 MEF 細胞若干支。將凍存管從液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內用75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。

4. 將凍存管內細胞懸液轉移至含 2 ml MEF 完全培養液的 15 ml 離心管內，以1000 rpm，離心 5 min，離心后將上清液吸除，另加入新鮮的 MEF 完全培養液 1 ml，重懸后按照一個(gè) T25 培養瓶鋪 1′10^6 的 MEF 細胞，平均加入到 T25 培養瓶中，輕輕搖勻后置于 37℃細胞培養箱。24 h 以后可以傳入小鼠胚胎干細胞。

5.復蘇或傳代小鼠胚胎干細胞前，將 T25 培養瓶中的 MEF 完全培養液吸除，加入 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液輕輕沖洗一遍后吸除，加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養液待用。

復蘇：

1.將小鼠胚胎干細胞凍存管從液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。

2. 將凍存管內細胞懸液轉移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液的 15ml 離心管內，以 1000 rpm，離心 5 min。

3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養液 2 ml，吹打懸浮。

4. 重復吹打，制成單細胞懸液，盡量避免氣泡。

5.  轉移至 1 個(gè)已經(jīng)鋪好 MEF 細胞的 T25 培養瓶中培養。

6. 每天更換小鼠胚胎干細胞完全培養液。

傳代：

1. 一般在復蘇后第 2-3 天傳代，視克隆大小和密度而定

2. 吸除廢液。

3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。

4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養瓶，輕輕晃動(dòng)，使胰酶覆蓋底面，置于 37℃培養箱內消化細胞。

5. 在顯微鏡下觀(guān)察，直至細胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。

6.  加 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液終止消化。

7.  以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。

8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液，多次輕輕吹打細胞， 制成單細胞懸液。

9. 加入足量的小鼠胚胎干細胞完全培養液，吹打混勻，細胞懸液分裝到鋪好 MEF 細胞的 T25 培養瓶中。一般地，一個(gè) T25 培養瓶加入 5-6 ml 培養液。放入 37℃培養箱內培養。每天換液。

傳代比例：1:4-1:7

凍存：

1.按傳代的方法將細胞消化下來(lái)，制成細胞懸液。

2.  以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經(jīng)預冷的凍存液，懸浮細胞。

3. 按每支存管內加入 500 ml 細胞懸液分裝到凍存管內，標記細胞名稱(chēng)、代數、凍存日期等基本信息。

4．將凍存管置于程序降溫盒內，-80℃過(guò)夜，轉入液氮。

凍存液配方：

小鼠胚胎干細胞完全培養液 60%，ES 級 FBS 30%，DMSO 10%

附：小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞分離的簡(jiǎn)易方法（差速貼壁法）：

1.培養中的小鼠胚胎干細胞，按傳代的操作方法將細胞用胰酶消化并吹打成單細胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細胞完全培養液重懸細胞， 吹打混勻，細胞懸液分裝到無(wú) MEF 細胞的培養皿或培養瓶（一般地，一個(gè)T25 培養瓶中培養的小鼠胚胎干細胞，在一個(gè) 10 cm 培養皿中進(jìn)行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細胞貼壁速度過(guò)快無(wú)法有效分離小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞）中。

2. 培養皿或培養瓶置于 37°C 培養箱內靜置 1 小時(shí)。

3.  1 小時(shí)后，絕大部分 MEF 細胞已貼在培養皿或培養瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細胞仍然懸浮在培養液中。收取培養液，進(jìn)行后續實(shí)驗。

注意事項

1.收到細胞后，若發(fā)現干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯(lián)系。

2.收到細胞先不開(kāi)瓶蓋，瓶身擦拭酒精后放在培養箱靜置2-4小時(shí)（視細胞密度而定）穩定細胞狀態(tài)。接著(zhù)在倒置顯微鏡下觀(guān)察細胞生長(cháng)情況，并對細胞進(jìn)行不同倍數拍照（建議收細胞時(shí)就整體外觀(guān)拍一張照片，觀(guān)察培養基的顏色和是否有漏液情況，隨后在顯微鏡下拍下細胞狀態(tài)，100*，200*各一張），觀(guān)察記錄細胞在運輸過(guò)程中是否有污染情況。作為我方進(jìn)行銷(xiāo)售依據。

3.由于細胞狀態(tài)受環(huán)境、操作和運輸等多方面因素影響，故本公司只保證客戶(hù)收到細胞后一周內的細胞狀態(tài)，故客戶(hù)需要售后時(shí)需出示收到細胞的時(shí)間證明及客戶(hù)提供收貨時(shí)間和發(fā)現問(wèn)題后客服人員溝通的時(shí)間證明，期間間隔時(shí)間不能大于7天。

4.所有動(dòng)物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過(guò)此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

從2011年開(kāi)始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫學(xué)實(shí)驗技術(shù)及論文潤色服務(wù)，協(xié)助客戶(hù)各類(lèi)實(shí)驗服務(wù)及論文潤色十余年，是您值得信賴(lài)的科研合作伙伴!

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