牛呼吸道疾病綜合癥（BRDC）核酸檢測試劑盒（熒光RT-PCR法)

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

商品名稱(chēng)：牛呼吸道疾病綜合癥（BRDC）核酸檢測試劑盒（熒光RT-PCR法）

【包裝規格】50T/盒

【預期用途】

牛呼吸道綜合癥是由病毒和細菌等多個(gè)病因相互作用的多重感染引起的。具體因素有天氣和飼料的改變、畜舍過(guò)于擁擠、動(dòng)物缺乏休息、牛棚不舒適、長(cháng)途運輸后等。在這種情況下，瘦弱而營(yíng)養不良的幼畜十分容易患上牛呼吸道綜合征。本試劑盒適用于檢測牛呼吸道分泌物，鼻眼分泌物，肺部等樣本中的牛呼吸道疾病綜合癥RNA，適用于牛呼吸道疾病綜合癥感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒用1對牛呼吸道疾病綜合癥特異性引物，結合1條特異性熒光探針，用一步法熒光RT-PCR技術(shù)對牛呼吸道疾病綜合癥RNA進(jìn)行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

說(shuō)明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融不超過(guò)5次，有效期12個(gè)月。

【適用儀器】

ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。

【標本采集】

取腸內容物和腸系膜淋巴結；待檢活畜，取分泌物和排泄物于離心管中。

【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃，長(cháng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò)6個(gè)月，標本運送應采用2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區）

1.1 樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從3個(gè)不同的位置稱(chēng)取樣品約1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中。

分泌物和排泄物樣品直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中。

1.2 RNA提取

為了使實(shí)驗結果穩定、有效、可靠，建議使用商品化的RNA 提取試劑盒進(jìn)行提取，嚴格按照對應試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽(yáng)性對照；樣品每滿(mǎn)7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：

3. 加樣（樣本處理區）

將步驟1提取的RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR擴增（核酸擴增區）

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內；

4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL；

熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）HEX檢測牛呼吸道疾病綜合癥，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

4.3 推薦循環(huán)參數設置：

5. 結果分析判定

5.1 結果分析條件設定

設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動(dòng)分析的結果分析，當曲線(xiàn)出現整體傾斜時(shí)，根據分析后圖像調節Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節)、stop值(一般可在5~20范圍內調節)，以及Threshold的Value值(上下拖動(dòng)閾值線(xiàn)至高于陰性對照)，重新分析結果。

5.2 結果判斷

陽(yáng)性：檢測通道Ct值≤38.0，且曲線(xiàn)有明顯的指數增長(cháng)曲線(xiàn)。

可疑：檢測通道38.0<Ct值<40.0，且出現典型擴增曲線(xiàn)的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現Ct值<40.0且有典型擴增曲線(xiàn)者為陽(yáng)性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結果無(wú)Ct值且無(wú)明顯的擴增曲線(xiàn)。

6. 檢測方法的局限性

? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

? 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì )出現假陽(yáng)性結果；

? 陽(yáng)性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會(huì )導致假陽(yáng)性結果；

? 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì )導致假陰性結果；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì )導致假陰性結果；

? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；

? 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無(wú)明顯擴增曲線(xiàn)且無(wú)Ct值顯示；

陽(yáng)性質(zhì)控品：擴增曲線(xiàn)有明顯指數生長(cháng)期，且Ct值≤30；

以上條件應同時(shí)滿(mǎn)足，否則實(shí)驗視為無(wú)效。

8. 性能指標

（1）敏感性：內控樣本敏感性為100%，綜合評價(jià)敏感性98%以上。最DI檢測限不低于1000copies/ml。

（2）特異性：100%。

（3）穩定性：批內及批間差異≤3%。

【注意事項】

? 所有操作嚴格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；

? 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完全混勻并短暫離心；

? 反應液應避光保存；

? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專(zhuān)用工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進(jìn)行，以免交叉污染；

? 實(shí)驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學(xué)實(shí)驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。

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