Western blot 實(shí)驗注意事項

1. 配膠時(shí)，建議先加水， 再加Tris-HCL緩沖液，并且每加一種液體就混勻膠液。加入的TEMED有毒，務(wù)必在通風(fēng)櫥中操作， 并且加入后立即混勻、灌膠。丙烯酰胺未聚合的單體有神經(jīng)毒性， 能夠經(jīng)皮膚吸收， 需戴手套操作。

2. AP作為催化劑能夠提供氧自由基促使丙烯酰胺單體聚合， TEMED作為加速劑能夠促進(jìn)AP釋放氧自由基，加速丙烯酰胺單體的聚合?？諝鉁囟容^低時(shí)稍稍多加TEMED可加快膠的凝固速度，但要確保AP未變質(zhì)，否則無(wú)效。

3. AP應現配現用， 否則變質(zhì)會(huì )導致膠不聚合。另外， TEMED添加過(guò)量會(huì )使膠凝得過(guò)快并且孔徑大小不一，影響蛋白的電泳，甚至可能燒膠。

4. 電泳內槽中應加入新鮮的電泳液， 并且應先拔梳子再安裝入電泳槽， 添加電泳液。這樣能夠沖洗掉各孔中碎膠， 確保電泳時(shí)條帶平直。

5. 建議兩邊加入預染的Protein Marker，方便觀(guān)察不同KDa蛋白的分離情況，也方便后續的裁膜。

6. 電轉液中一般需加入甲醇或乙醇， 而電轉時(shí)的放熱會(huì )加速醇類(lèi)的揮發(fā)進(jìn)而影響下一次重復使用時(shí)的電轉效果。重復使用電轉液時(shí)應考慮到醇類(lèi)的揮發(fā)而適當延長(cháng)電轉時(shí)間， 最好是每次電轉時(shí)都使用新的電轉液。不同KDa的蛋白電轉的條件不同， 所以可以針對目的蛋白進(jìn)行切膠， 然后在不同條件下電轉。

7. 蓋上PVDF膜后， 不要再輕易移動(dòng)， 否則條帶會(huì )模糊。兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì )發(fā)生短路，蛋白會(huì )轉不過(guò)來(lái)。

8. 封閉常用脫脂奶粉或BSA，建議建議做磷酸化蛋白的western時(shí)使用BSA（牛血清蛋白） 作為封閉液。奶粉含有酪蛋白（一種磷酸化蛋白），如果用奶粉，有可能出現背景深的現象。并且脫脂奶粉含磷酸酶， 磷酸酶與膜上的磷酸化蛋白接觸可使之去磷酸化， 用磷酸化特異性抗體分析磷酸化蛋白時(shí)會(huì )受到影響。

9. 一抗在四度孵育時(shí)能夠延緩抗體的衰減速度， 提高重復利用的次數。建議嚴格按照要求進(jìn)行洗膜， 不要輕易減少洗膜的次數和時(shí)間。Tween20作為一種非離子表面活性劑， 能夠減少非特異性的抗體結合， 降低背景。所以如果曝光后發(fā)現背景高，可以將1XPBST/TBST中Tween20從0.05%提高到0.5%，并且增加洗膜次數。

10. 曝光時(shí)盡量將目標蛋白和內參一起曝光， 便于比較。如果使用傳統的壓片曝光， 可以壓兩張甚至更多的片子并折角， 折角可以確定方向， 增加壓片數量可以控制曝光強度。離膜最近的片子記錄亮度低的蛋白條帶的情況， 離膜遠的蛋白可以保證亮度強的蛋白不過(guò)曝。

11. 曝光時(shí)多使用ECL發(fā)光試劑盒， 注意含量稀少的磷酸化蛋白等可以使用超敏型試劑以增加亮度， 而內參等含量較多的蛋白則應使用普通的ECL發(fā)光試劑防止過(guò)亮，阻礙曝光。

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