WB實(shí)驗過(guò)程中常見(jiàn)條帶問(wèn)題分析解決方法

一、除了目的蛋白條帶外有很多條雜帶

1. 一抗抗體差異，部分不常見(jiàn)的分子抗體是多克隆的，雜帶比較多。

2.一抗4℃孵育過(guò)夜時(shí)，如果一抗的孵育濃度較高，也容易出現雜帶。 一般可按抗體說(shuō)明書(shū)來(lái)設定稀釋濃度。

3.二抗孵育時(shí)間過(guò)長(cháng)或者二抗濃度過(guò)高也會(huì )導致雜帶增多。一般二抗規定的孵育時(shí)間為室溫1-2小時(shí)， 一般1小時(shí)足矣， 時(shí)間過(guò)長(cháng)易出現非特異性條帶； 二抗一般1：10000稀釋。

4.一抗與二抗之間TBST洗膜時(shí)間較短，次數較少，常規應該洗三次，一次10min。

5.在封閉， 或是一抗二抗孵育的這種wb中比較關(guān)鍵的步驟都會(huì )用到TBST，其配方中比較關(guān)鍵的是Tween-20，是一種非離子型表面活性劑，對抗原抗體蛋白有保護作用， 也可以減少抗體對抗原的非特異性作用， 用于洗脫未結合的抗體，減少非特異性結合， 一般用量是1ml/L。

6.一般的抗體只能識別抗原蛋白中的線(xiàn)性序列結構表位即一級結構，煮蛋白目的為打開(kāi)折疊的空間結構， 緩沖液中含有的SDS可斷裂蛋白分子內和分子間的氫鍵， 使分子去折疊， 破壞蛋白質(zhì)分子的二級和三級結構，若煮蛋白時(shí)間較短， 或者loading buffer有問(wèn)題， 都會(huì )影響抗原抗體結合， 影響最后的顯影結果。對于容易形成多聚體的蛋白，可以延長(cháng)煮樣時(shí)間， 99℃10min。

7.有時(shí)候目的蛋白在所測蛋白樣品中是低表達蛋白，顯影后重影也較多。

8. 體內表達的蛋白具有很多種修飾形式， 如甲基化、乙?；?、磷酸化等， 會(huì )影響結果，可以參考抗體網(wǎng)站信息及查閱文獻來(lái)解決。

9. 蛋白樣本降解， 也會(huì )造成雜帶過(guò)多（比原來(lái)位置低的地方出現主帶， 也會(huì )出現一些其他的帶， 所有的條帶都比正常的低且模糊不清），排除此種原因需注意在冰上裂解蛋白， 時(shí)間不要太長(cháng)， 裂解液中加入蛋白酶抑制劑， 定量后及時(shí)煮樣， 使其穩定，并保存于-20℃中，煮好的樣品盡量減少在室溫中的時(shí)間。

二、WB條帶背景有黑點(diǎn)點(diǎn)

脫脂牛奶封閉時(shí)，脫脂奶粉顆粒未完全溶解。

三、WB條帶顯影無(wú)條帶

1.比較簡(jiǎn)單的原因可能是目的蛋白所出現的分子量位置與說(shuō)明書(shū)介紹的分子量位置差距較遠， 切膠時(shí)切掉了， 在第一次跑某目的蛋白時(shí)， 可采取整膜轉，看一下能否跑出條帶。當然蛋白分子量偏高或偏低也有可能是因為選擇的膠的濃度與目的蛋白的濃度不對應所致。

2.一抗的濃度較低， 可適當增加一抗抗體濃度，或者更換效價(jià)比較高的一抗。一抗孵育的時(shí)間可適當延長(cháng)， 注意不要太長(cháng)， 一抗蒸發(fā)會(huì )干膜。在實(shí)際操作中， 如果用透明封口袋封膜， 最后孵一抗的效果會(huì )比用孵育盒強， 因為既可以減少一抗的用量， 又可以防止膜在抗體表面漂浮， 孵育不充分， 但是要注意用封口袋封膜時(shí)， 排盡氣泡， 切不要一次封太多張膜， 膜重疊在一起也會(huì )導致孵育不充分。同時(shí)也要注意一抗保存要得當，否則效價(jià)會(huì )降低。

3. 當所測蛋白樣品中目的蛋白的含量很低時(shí)， 也會(huì )出現無(wú)條帶， 注意增加上樣量， 設置好陽(yáng)性對照以利于結果分析， 提蛋白時(shí)也要注意操作時(shí)間， 冰上操作，在裂解液中加蛋白酶抑制劑，提的細胞或者組織樣品越新鮮越好。

4.轉膜問(wèn)題。轉膜的時(shí)間和電壓或者電流強度要依據目的蛋白的分子量來(lái)設定。時(shí)間過(guò)短， 電壓過(guò)低， 沒(méi)轉上或是時(shí)間過(guò)長(cháng)， 電壓過(guò)高轉過(guò)了， 都會(huì )影響最后的結果?？梢宰鲱A實(shí)驗或者根據前輩的經(jīng)驗來(lái)設定轉膜條件。當目的蛋白分子量過(guò)小時(shí)（10KDa），可以選擇兩張膜疊在一起轉，選用小孔徑的膜，縮短轉膜時(shí)間。當然， 轉膜時(shí)電極插反或者膜和膠在轉膜夾的位置擺放不正確，或者轉膜夾與轉膜芯方向不對，膜轉反了會(huì )直接導致實(shí)驗失敗。

5.洗膜時(shí)時(shí)間過(guò)長(cháng)次數過(guò)多也會(huì )影響結果。

6. 發(fā)光液失效， 發(fā)光液過(guò)期或者未注意避光， 記得現配現用， 若樣品中目的蛋白表達量較低，可適當延長(cháng)顯影時(shí)間。

7. Tween-20濃度過(guò)高時(shí)， 也會(huì )干擾抗體相互作用， 洗去PVDF膜上的目的蛋白。

8.最不應該犯的錯誤是一抗和二抗種屬不搭配。

四、WB條帶有邊緣規則白點(diǎn)

1. 轉膜時(shí)PVDF膜與膠之間氣泡未趕凈。轉膜過(guò)程要盡量去除氣泡， 使膜、濾紙和膠緊密結合。

2.用封口袋孵一抗時(shí)，未除凈氣泡。

五、顯影后膠片背景太高

1. 洗膜不充分。

2. 二抗濃度過(guò)高，降低二抗濃度。

3. 一抗特異性不強。

4. 曝光時(shí)間過(guò)長(cháng)，適當減少顯影時(shí)間。

5. 封閉不充分，延長(cháng)封閉時(shí)間或者更換封閉液。

六、WB條帶歪斜

1. 最可能出現的問(wèn)題是凝膠制備的問(wèn)題， 灌膠時(shí)膠不平整。例如APS與TEMED加的量過(guò)多， 凝膠凝固速度過(guò)快。加完各組成成分后沒(méi)有很好地混勻， 濃度不一。灌膠后用醇類(lèi)壓膠效果好于蒸餾水， 用蒸餾水壓膠后， 可輕微上下磕桌面，減小水的表面張力。在平整的桌面上配膠。配膠時(shí)室內溫度也很重要，太低凝固時(shí)間較長(cháng)， 分離膠漏的較多， 膠面較低， 蛋白不能充分分離。室內溫度過(guò)高膠凝固時(shí)間過(guò)快， 不易平整。拔梳子時(shí)要左右手用力均勻， 速度不要太快， 否則上樣孔扭曲。每個(gè)孔上樣量要一致。另外， 如果配置好的膠板有氣泡或者配膠時(shí)用的水有雜質(zhì)等不溶性顆粒，也會(huì )影響跑膠， 導致條帶扭曲。

2.轉膜夾老舊，海綿變薄，三明治結構不緊湊。

3.如果整個(gè)泳道左右歪曲， 可能是上樣時(shí)多余的膠孔沒(méi)有用空的loading buffer補齊。

4.電泳時(shí)玻璃板未夾緊漏液，電壓不穩，溴酚藍的線(xiàn)在膠上有可見(jiàn)扭曲。

七、條帶中央區發(fā)白

上樣過(guò)多，導致信號瞬間淬滅。

八、左右孔道條帶粘連

1.上樣量過(guò)多，或者分離膠與濃縮膠間有空隙。

2.由于電泳完成后沒(méi)有及時(shí)轉膜，樣品彌散。

九、顯影時(shí)出現不均一的背景

在一抗、二抗、封閉、或者洗膜時(shí)可能出現了干膜。

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