人外周血淋巴細胞分離液說(shuō)明書(shū)
 
【包裝規格】
 200ml/瓶
 【貨號】
 LTS1077
 【實(shí)驗前準備】
 A． 適用儀器
 zui大離心力可達 1200g 的水平轉子離心機
 B．耗材

 
全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
 
首先根據樣本量大小，分以下幾種情況：
 
一、 使用 15ml 離心管時(shí)：
 
情況 A：血液樣本量小于 3ml 時(shí)，實(shí)驗方法如下：
 
1. 取一支 15ml 離心管，加入 3ml 分離液。
 
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，400-650g，離心 20-30min（注：根據血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(cháng)，具體離心條件 需客戶(hù)自行摸索，以達到分離效果）。
 
3. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
 
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中 加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
 
5. 250g，離心 10min。
 
 6. 棄上清。
 
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
 
8. 250g，離心 10min。
 
9. 重復 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續實(shí)驗所需相應液體重懸細胞。 情況 B：血液樣本量為 3-6ml 時(shí)，實(shí)驗方法如下：
 
1. 取一支 15ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
 
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，450-650g，離心 20-30min（注：根據血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(cháng)，具體離心條件 需客戶(hù)自行摸索，以達到分離效果，但zui大離心力不超過(guò) 1200g）。
 
3. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
 
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中 加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
 
5. 250g，離心 10min。
 
6. 棄上清。
 
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
 
8. 250g，離心 10min。
 
9. 重復 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續實(shí)驗所需相應液體重懸細胞。
 
二、 使用 50ml 離心管時(shí)：
 
情況 A：血液樣本量為 6-10ml 時(shí)，實(shí)驗方法如下：
 
1. 取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
 
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-950g，離心 20-30min（注：根據血 液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(cháng)，具體離心條件 需客戶(hù)自行摸索，以達到分離效果，但zui大離心力不超過(guò) 1200g）。
 
3. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
 
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中 加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
 
5. 250g，離心 10min。
 
 6. 棄上清。
 
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
 
8. 250g，離心 10min。
 
9. 重復 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續實(shí)驗所需相應液體重懸細胞。 情況 B：血液樣本量為 10-20ml 時(shí)，實(shí)驗方法如下：
 
1. 取一支 50ml 離心管，先加入與血液樣本等量的分離液。
 
2. 用吸管小心吸取血液樣本加于分離液之液面上，500-1100g，離心 20-30min（注：根據 血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時(shí)間越長(cháng)，具體離心條 件需客戶(hù)自行摸索，以達到分離效果，但zui大離心力不超過(guò) 1200g）。
 
3. 離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色淋巴 細胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細胞層。
 
4. 用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一 15ml 離心管中，向所得離心管中 加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。
 
5. 250g，離心 10min。
 
6. 棄上清。
 
7. 用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。
 
8. 250g，離心 10min。
 
9. 重復 6、7、8，棄上清后以 0.5ml 后續實(shí)驗所需相應液體重懸細胞。
 
【注意事項】
 
1. 全過(guò)程樣本、試劑及實(shí)驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得的實(shí)驗結果， 在取血 2h 內進(jìn)行實(shí)驗，血液存放時(shí)間越長(cháng)，細胞分離效果越差。血液放置超過(guò) 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。
 
2. 本實(shí)驗不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無(wú)靜電、低靜電離 心管及未經(jīng)堿處理過(guò)后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面 會(huì )變成毛面，影響細胞分離效果。
 
3. 吸取過(guò)多的淋巴細胞層及分離液層會(huì )導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒
 
細胞數量增加。
 
4. 吸取過(guò)多的淋巴細胞層上層溶液會(huì )導致血漿蛋白及血小板混雜。
 
5. 如所實(shí)驗后細胞得率或活性過(guò)低，請以尋求幫助，具體
 
詳見(jiàn)下方生產(chǎn)企業(yè)信息。

 
6. 當血液樣本粘度過(guò)高需稀釋時(shí)，*稀釋方法：將血液與樣本稀釋液（產(chǎn)品編號： 2010C1119）1:1 稀釋混勻備用。注：不當的稀釋方法會(huì )降低細胞得率及活性。如血液樣
 
本經(jīng)過(guò)稀釋則分離過(guò)程中需適當降低離心力和離心時(shí)間。
 
【儲存條件及有效期】
 
18-25℃保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟 封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現白色結晶，影響分離效果。 【參考值（參考范圍）】
 
本實(shí)驗淋巴細胞提取率及純度均大于 80%。
 1. 所獲得淋巴細胞的培養技術(shù)。
 
2. 所獲得淋巴細胞的核酸提取技術(shù)。
 
3. 所獲得淋巴細胞的鑒定方法 A.流式細胞技術(shù) B.免疫組化技術(shù)
 
C.原位雜交技術(shù)
 
D.PCR 技術(shù) 注：上述技術(shù)方案詳情請登陸本搜索“細胞
 
分離、純化、擴增及鑒定指導手冊"，并在說(shuō)明書(shū)項目欄下下載使用。 
【可能存在的問(wèn)題及解決方法】
1.由于血液粘度、細胞密度等差異可能造成的問(wèn)題及解決方案如下表所示：

 
 
 
2. 本分離液分離細胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地 區客戶(hù)可根據當地情況對離心條件進(jìn)行適當調整。建議對離心條件進(jìn)行調整時(shí)，恒定離 心時(shí)間，對離心轉速進(jìn)行調整。
 
3. 本分離液依照標準，全部使用藥用級原料，性能指標與國產(chǎn)同類(lèi)產(chǎn)品略有不同，可
 
能出現紅細胞沉降不*的情況，可以適當加大離心轉速。
 
注：在對離心條件進(jìn)行調整時(shí)，離心轉速的加減以 50-100g 為基數，直至達到分離效果，離心力zui小不得小于 400g，zui大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準。