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線(xiàn)粒體復合體Ⅴ試劑盒

線(xiàn)粒體復合體Ⅴ試劑盒

產(chǎn)品型號:

所屬分類(lèi):其它ELISA

產(chǎn)品時(shí)間:2024-08-30

簡(jiǎn)要描述:線(xiàn)粒體復合體Ⅴ試劑盒說(shuō)明書(shū)
復合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi,通過(guò)測定Pi增加速率來(lái)測定復合體Ⅴ活性。線(xiàn)粒體復合體Ⅴ試劑盒

詳細說(shuō)明:

貨號YJ1219                       規格:100管/48樣

線(xiàn)粒體復合體Ⅴ試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

正式測定前務(wù)必取2-3個(gè)預期差異較大的樣本做預測定

測定意義:

線(xiàn)粒體復合體Ⅴ試劑盒

線(xiàn)粒體復合體Ⅴ試劑盒

線(xiàn)粒體復合體Ⅴ又稱(chēng)F1F0-ATP合酶,廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養細胞的線(xiàn)粒體中,由F1和F0兩個(gè)亞單位組成。該酶利用呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子電化學(xué)梯度催化ATP合成,也可逆過(guò)程水解ATP。此外,復合體Ⅴ還存在于葉綠體、異養菌和光合細菌中。復合體Ⅴ是線(xiàn)粒體氧化磷酸化和葉綠體光合磷酸化合成ATP的關(guān)鍵酶。

測定原理:

復合體Ⅴ水解ATP產(chǎn)生ADP和Pi,通過(guò)測定Pi增加速率來(lái)測定復合體Ⅴ活性。

需自備的儀器和用品:

可見(jiàn)分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制:

試劑一:100mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑二:80mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑三:2mL×1 瓶,-20℃保存;

試劑四:粉劑×1 支,-20℃保存;臨用前加入2mL蒸餾水,充分溶解備用,用不完的試劑仍-20℃保存;

試劑五:8mL×1 瓶,4℃保存;

試劑六:粉劑×1 瓶,4℃保存;臨用前加入4mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑七:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑八:粉劑×1瓶, 4℃保存;臨用前加入10mL蒸餾水,充分混勻;溶解后4℃保存一周;

試劑九:液體 10mL×1 瓶,室溫保存。

定磷試劑的配制:按H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷試劑應為淺黃色。若無(wú)色則試劑失效,若是藍色則為磷污染(請根據需要,用多少配多少)。

注意:配試劑建議用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,或者一次性塑料器皿,以避免磷污染。

樣本的前處理:

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線(xiàn)粒體蛋白的分離:

① 準確稱(chēng)取0.1g組織或收集500萬(wàn)細胞,加入1mL試劑一和10uL試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

② 將勻漿 600g,4℃離心 5min。

③ 棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心 10min。

④ 上清液即為除去線(xiàn)粒體的胞漿蛋白,可用于測定從線(xiàn)粒體泄漏的復合體Ⅴ(此步可選

做)。

⑤ 步驟④中的沉淀即為線(xiàn)粒體,加入800uL試劑二和8uL試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3s,間隔10秒,重復30次),用于復合體Ⅴ酶活性測定。

測定步驟:

  • 酶促反應(在EP管中加入下列試劑)

試劑名稱(chēng)(μL)

對照管

測定管

試劑四

20

20

試劑五

80

80

樣本

 

100

混勻, 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)準確水浴 30min

試劑六

40

40

樣本

100

 

混勻,4000g,25℃離心 10min,取上清液

  • 定磷(在EP管或96孔板中加入下列試劑)

上清液

30

30

定磷試劑

170

170

混勻,室溫靜置10min后,在660nm處讀取A測定管和A對照管,計算ΔA=A測定管-A對照管。每個(gè)測定管設一個(gè)對照管。

復合體Ⅴ活性計算:

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下:

標準條件下測定的回歸方程為y= 1.2487x + 0.0361;x為標準品濃度(mmol/L),y為A 值。

1、組織中復合體Ⅴ活性的計算:

(1)按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無(wú)機磷定義為一個(gè)酶活性單位。復合體Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(V樣×Cpr) ÷T=64× (ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

(2)按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol無(wú)機磷定義為一個(gè)酶活性單位。復合體Ⅴ活性(nmol/min /g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =51.7× (ΔA-0.0361) ÷W

(3)按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1nmol無(wú)機磷定義為一個(gè)酶活性單位。復合體Ⅴ活性(nmol/min/104cell)=[(ΔA-0.0361) ÷1.2487×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.103× (ΔA-0.0361)

V 反總:反應體系總體積,2.4×10-4 L; V 樣:加入樣本體積,0.1 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.808 mL;T:反應時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細胞或細菌總數,500 萬(wàn)。

b.使用96孔板測定的計算公式如下:

標準條件下測定的回歸方程為y=0.624x + 0.0361;x為標準品濃度(mmol/L),y 為A 值。

1、組織中復合體Ⅴ活性的計算:

(1)按樣本蛋白濃度計算

單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol無(wú)機磷定義為一個(gè)酶活性單位。復合體Ⅴ活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(V 樣×Cpr) ÷T=128× (ΔA-0.0361) ÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

(2)按樣本鮮重計算

單位的定義:每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol無(wú)機磷定義為一個(gè)酶活性單位。復合體Ⅴ活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T=103.4× (ΔA-0.0361) ÷W

(3)按細菌或細胞密度計算

單位的定義:每1萬(wàn)個(gè)細菌或細胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol無(wú)機磷定義為一個(gè)酶活性單位。復合體Ⅴ活性(nmol/min /104cell)=[(ΔA-0.0361) ÷0.624×V 反總×106]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.206× (ΔA-0.0361)

V 反總:反應體系總體積,2.4×10-4 L;V 樣:加入樣本體積,0.1 mL;V 樣總:加入提取液體積,0.808 mL;T:反應時(shí)間,30 min;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細胞或細菌總數,500 萬(wàn)。

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