CCK8細胞實(shí)驗代做

產(chǎn)品型號：

所屬分類(lèi)：細胞生物學(xué)實(shí)驗

產(chǎn)品時(shí)間：2024-08-30

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實(shí)驗原理

CCK-8 (Cell Counting kit-8)試劑中含有WST-8:化學(xué)名: 2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基.苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽]，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸.二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞線(xiàn)粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臌產(chǎn)物(Formazan)， 生成的甲贊物的數量與活細胞的數量成正比，可采用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長(cháng)處測定其光吸收值，間接反映活細胞數量。

常見(jiàn)問(wèn)題FAQ

Q: CCK-8試劑盒檢測細胞增殖和毒性的優(yōu)點(diǎn)有哪些?

A: A: CCK- 8較傳統的MTT法優(yōu)點(diǎn)在于

1) MTT被線(xiàn)粒體內的一些脫氫還原酶還原成的formazan不是水溶性的，需要有特定的溶解液來(lái)溶解而CCK- 8產(chǎn)生的formazan都是水溶性的,可以省去后續的溶解步驟，

2)CCK-8檢測靈敏度更高，更加穩定;

3)酚紅和血清對其測定無(wú)明顯影響;

4)不必去上清，不必洗,滌細胞更加簡(jiǎn)便;

5)對細胞無(wú)明顯毒性，加入顯色后，可以在不同時(shí)間反復用酶標儀讀板使檢測時(shí)間更加靈活，而且不影響細胞進(jìn)行后續實(shí)驗。

Q :在做細胞的加藥實(shí)驗時(shí)，藥物對CCK-8測定是否有影響?如何解決?

A: 1)注意如果藥物具有還原性(如維生素C)，會(huì )和CCK-8發(fā)生顯色反應增加吸光度。

2)藥物中的金屬對CCK-8顯色有影響:當終濃度為1mM的氯化亞鉛、氧化鐵、硫酸銅會(huì )抑制5%,15%, 90%的顯色反應使靈敏度降級。如果終濃度是10mM的話(huà)，將會(huì )100%抑制。解決辦法:首先要確認藥物是否有吸收,在含有藥物的培養基中加入CCK-8,測定450nm的吸光度如果它的吸光度比不含藥物的培養基(加CCK-8)的吸光度高，則證明藥物有影響，可在加CCK-8之前更換培養基，去掉藥物的影響。

3) 由于培養基中可能含有氧化還原反應的物質(zhì)，在正式實(shí)驗之前建議使用一個(gè)孔作一 下檢測，有必要先確認培養基和CCK-8是否反應。-般正常的0D值應該在0.4以下。

Q: CCK-8如何設定空白對照?

A :在不含細胞的培養基中加入CCK-8.培養-定的時(shí)間，測定450nm的吸光度即為空白對照。 在做加藥實(shí)驗(細胞毒性實(shí)驗)時(shí)，還應考慮藥物的吸收可在不含細胞.加入藥物的培養基中加入CCK-8,培養-定的時(shí)間，測定450nm的吸光度作為空白對照。

Q: CCK-8對于不同的細胞，靈敏度是否-樣?

A:不一樣,懸浮細胞較貼壁細胞難染色。對于貼壁細胞,一般加入CCK 8培養1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過(guò)延長(cháng)CCK-8的加入時(shí)間或增加細胞數量來(lái)解決。

Q :可否采用CCK-8法進(jìn)行腫瘤細胞的基質(zhì)黏附實(shí)驗?

A :可以，以層粘連蛋白(Ln)包被96孔板通過(guò)計算不同時(shí)間點(diǎn)孔板中貼壁細胞的數量反映細胞的黏附性。細胞的黏附性越強，則單位時(shí)間內貼于鋪有L n板底的細胞數量越多去除尚末貼壁的細胞后,應用CCK-8等方法計量細胞數量便可間接反映不同細胞或不同處理的細胞黏附能力的差異。

Q :可否采用CCK-8法進(jìn)行藥物的IC50檢測?

A :可以，將細胞培養后按照不同濃度的藥物處理定時(shí)間后進(jìn)行CCK-8檢測，根據吸光度繪制曲線(xiàn)，計算該藥物抑制細胞數量一半時(shí)的濃度(IC50)。

參考文獻

1. Ishiyama M, Miyazono Y, Sasamoto K, et al. A highly water-soluble disulfonated tetrazolium salt as achromogenicindicator for NADH as well as cell viability. Talanta 1997.44(7): 1299-1305.

2. Ishiyama M, Tominaga H, Shiga M, et al. A combined assay of cell viability and in vitro cytotoxicitywith a ，highlywater-soluble tetrazolium salt,neutral red andcrystal violet.Biol Pharm Bull1996, 19(11):1518-1520.

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