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多克隆抗體制備服務(wù)

多克隆抗體制備服務(wù)

產(chǎn)品型號:

所屬分類(lèi):免疫學(xué)實(shí)驗

產(chǎn)品時(shí)間:2024-08-30

簡(jiǎn)要描述:服務(wù)名稱(chēng): . 多克隆抗體制備服務(wù)
提供商: 上海研謹生物
規格: 實(shí)驗代做服務(wù)

詳細說(shuō)明:

服務(wù)名稱(chēng):  多克隆抗體制備服務(wù)

提供商:      上海研謹生物

規格:        實(shí)驗代做服務(wù)

多克隆抗體制備服務(wù)

 

 

 

 

 

 

多抗一般制備流程:*抗原的準備- +兔子的免疫-→ 效價(jià)檢測和終放- +抗體親和純化- +抗體的濃縮和保存。

 

具體實(shí)驗步驟如下:

1.兔子的準備

挑選健康的6周大小的新西蘭大白兔兩只(約2Kg) ,使其適應新的生活環(huán)境,至少穩定幾天再進(jìn)行*取血、預采血(作陰性參照用)

1.1將兔子小心的放入固定的架中,使兔子平靜;

1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可見(jiàn)(也可不剃);

1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精涂抹血管部位使血管膨脹;

1.4用注射器從耳靜脈抽取約10ml血液(約5ml血清);

1.5小心抽出針頭,適當按壓傷口以免流血,然后用酒精棉球消毒傷口;

1.6將收集的血液置于37 C滅活30min,后置于4" C過(guò)夜使其凝結釋放血清;

1.7將凝結好的血液在10000r / min離心10min; h.收集 上清,即為血清。

2.兔子的免疫

2.1注射兩只兔子的抗原為1ml,抗原緩沖溶液必須不含對兔子有害的化學(xué)試劑每只兔子初次免疫400ug抗原比較適合,也可適當減少以獲得更好的結果,后續免疫每次為100ug即可。

2.2將1m的佛氏*佐劑與準備好的1m抗原充分混勻,呈乳白色; .

2.3小心從籠中取出兔子,織兔子免疫4個(gè)部位(背部和大腿根部均可),每個(gè)部位250ul,針頭呈45度角插入皮下1-2cm,注射完后停留數秒以防止抗原外流。

2.4兔疫周期為20天,免疫完后7-10天取血(包括中途測試取血和終放血),總共免疫4-5次。

 

3.效價(jià)檢測

3.1 2個(gè)參照陰性參照為預取血血清,均以1抗起始濃度稀釋(封閉稀釋液);陽(yáng)性參照為以前

 

陽(yáng)性血清

3.2于96孔板中每孔滴加100ul, 1ug/m抗原,于49C過(guò)夜, 也可以37°C孵育2小時(shí)。

3.3倒掉抗原溶液,每孔加入200u的封閉液, 49C過(guò)夜或者379C孵育2小時(shí)。

3.4倒去封閉液,在吸水紙上拍打盡量吸干殘留液體,用洗滌液洗板三次每次盡量拍干殘留液體,若要放置一段時(shí)間, 37°C烘干并用封口袋封好于20°C存放。

3.5取包被好的96孔板,第---孔加入陰性 參照液100ul,第二孔加入陽(yáng)性參照液100ul,第三孔加入1:500的待測抗血清,后續各孔在此基礎上倍比稀釋,于37°C孵育1 小時(shí)。

3.6倒掉液體,用洗滌液洗板三次,拍干。每孔加入100u的HRP標記的小鼠抗兔lgG (1: 2000稀釋),于37°C孵育45分鐘。

3.7倒掉液體,用洗滌液洗板三次,拍干。每孔加入100u的TMB底物(Sigma 單組份TMB ) 37°C孵育5-20分 鐘(根據顏色深淺來(lái)決定顯色的時(shí)間)。

3.8每孔加入50u的終止液(2N H2SO4), 在酶標儀上讀取波長(cháng)450nm處的吸光值。

抗體效價(jià)檢測達到100萬(wàn)以上后可以對兔子進(jìn)行終放血??贵w的純化

 

4.抗體的親和--親和柱的制備

4.1 稱(chēng)取1mg CNBr- Sepherose 4B的瓊脂糖凝膠加入2mmol/ L的鹽酸中,4" C過(guò)夜使其充分溶漲,可獲得3m溶漲膠。

4.2將凝膠轉移入純化柱中,用約20ml 2mmol / L的鹽酸洗介質(zhì)3次。

4.3用偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)- -次,因為活化基團在偶聯(lián)緩沖液PH值下易水解,所以此步驟在幾分鐘內完成。

4.4將溶解在5ml偶聯(lián)緩沖液中的5-10mg的抗原加入凝膠中

4.5室溫下輕輕混合搖動(dòng)2-4小時(shí),或4" C過(guò)夜,如需測定結合效率此步驟結束后取少量溶液待測。用20ml的偶聯(lián)緩沖液洗介質(zhì)一-次。

4.6加入15m1 1% BSA溶液室溫下孵育2小時(shí)或4" C過(guò)夜。

4.7用磷酸鹽緩沖液洗滌介質(zhì)3次以上,每次15m以上h.

4.8抗原固相化完成,可用于純化。

4.9若不立即使用或者使用后,用20%的乙醇封存。

 

5.抗血清的純化和保存

5.1抗血清用PBS等體積稀釋?zhuān)?000-10000 / min離心15分鐘,取上清.

5.2用10倍體積的PBS清洗抗原親和柱以平衡柱子。

5.3將稀釋好的抗血清10m加入平衡好的柱子中。

5.4室溫下輕輕混合搖動(dòng)2-4小時(shí),或4" C過(guò)夜

5.5用10倍體積的PBS清洗抗原柱,以洗去結合在柱子上的雜蛋白

5.6用2倍體積的抗體洗脫液洗滌柱子,以得到特異性抗體

5.7用10倍體積PBS平衡柱子

5.8用20%的酒精封存柱子,4'C保存。

在得到洗脫的抗體后,經(jīng)蔗糖或聚乙二醇濃縮后于PBS中透析除鹽,使用紫外可見(jiàn)分光光度計在波長(cháng)280nm處測定抗體OD值,所得OD值除以1.35即為所測抗體的濃度,添加40-50%甘油置于20^C可長(cháng)期保存。

 

 

實(shí)驗代做服務(wù):

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CCK8檢測

基因組DNA提取

 

蛋白相互作用分析

Western Blot

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動(dòng)物模型服務(wù)

流式細胞檢測

ROS氧化分析

激光共聚焦

DNA甲基化實(shí)驗

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鈣離子濃度檢測

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動(dòng)物實(shí)驗

探針合成

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石蠟/冰凍切片

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線(xiàn)粒體膜電位(MMP)檢測

細胞生長(cháng)曲線(xiàn)的測定

藥理毒理動(dòng)物實(shí)驗

 

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非標定量(Label-free)實(shí)驗



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